← 返回分析流程中心创建时间 2026/6/3 分析难度 高级 推荐场景 长读长转录组 预计耗时 3-5 天
Pipeline Detail
Long-read Transcriptomics长读长、翻译组与非模式物种
长读长转录组 Iso-Seq/Nanopore
面向 PacBio Iso-Seq 和 Oxford Nanopore cDNA/direct RNA 的长读长转录组流程，覆盖 isoform discovery、FLAIR/TALON/StringTie2、alternative promoter/polyA 和表达定量。
Metadata
流程元数据
先看应用场景、输入输出和工具依赖，再进入正文命令细节。
Difficulty
高级
Scenario
长读长转录组
Estimated Time
3-5 天
Tools
STARStringTieIso-SeqNanoporeFLAIRTALON
Inputs
FASTQBAMGTFTPM
Outputs
isoform annotationreport
Workflow DAG
流程图
用步骤节点快速理解这个分析从原始数据到结果报告的流转关系。
STEP 1
→建立长读长项目
STEP 2
→reads QC
STEP 3
→minimap2 比对
STEP 4
→isoform collapse
STEP 5
→FLAIR/TALON/StringTie2
STEP 6
→isoform 定量
STEP 7
→promoter/polyA 分析
STEP 8
→novel isoform 注释
STEP 9
isoform 报告
Protocol
流程文档
正文保留 Markdown 排版、代码语言标识和表格样式，适合边学边复现。
长读长转录组 Iso-Seq/Nanopore
一、项目目录
mkdir -p longread_tx_project/{00_metadata,01_reads,02_qc,03_alignment,04_isoforms,05_quant,06_annotation,07_polyA,report}
二、示例数据
00_metadata/sample_info.csv：
sample_id,platform,condition,reads
Sample_1,PacBio_IsoSeq,Ctrl,01_reads/Sample_1.hifi.fastq.gz
Sample_2,ONT_cDNA,Treat,01_reads/Sample_2.fastq.gz
isoform 表示例：
isoform_id,gene_id,category,length
PB.1.1,GENE1,known,2400
PB.1.2,GENE1,novel_exon_combination,3100
三、整体流程图
flowchart TD
A[PacBio HiFi / ONT reads] --> B[read QC]
B --> C[minimap2 splice alignment]
C --> D[FLAIR correct/collapse 或 TALON]
D --> E[isoform annotation]
D --> F[isoform quantification]
E --> G[novel isoform discovery]
E --> H[alternative promoter/polyA]
F --> I[differential isoform usage]
G --> J[isoform report]
H --> J
I --> J
四、minimap2 比对
minimap2 -ax splice -uf -k14 ref/genome.fa 01_reads/Sample_1.hifi.fastq.gz | samtools sort -@ 8 -o 03_alignment/Sample_1.sorted.bam
samtools index 03_alignment/Sample_1.sorted.bam
ONT cDNA：
minimap2 -ax splice ref/genome.fa 01_reads/Sample_2.fastq.gz | samtools sort -@ 8 -o 03_alignment/Sample_2.sorted.bam
五、FLAIR 流程
flair correct -q 03_alignment/Sample_1.sorted.bam -g ref/genome.fa -f ref/genes.gtf -o 04_isoforms/Sample_1
flair collapse -g ref/genome.fa -r 01_reads/Sample_1.hifi.fastq.gz -q 04_isoforms/Sample_1_all_corrected.bed -f ref/genes.gtf -o 04_isoforms/Sample_1_flair
flair quantify -r reads_manifest.tsv -i 04_isoforms/Sample_1_flair.isoforms.fa -o 05_quant/flair_quant
六、TALON 思路
TALON 适合对长读长转录本进行注释分类。
talon_initialize_database --f ref/genes.gtf --g hg38 --a gencode --o 06_annotation/talon
talon --f 03_alignment/Sample_1.sorted.bam --db 06_annotation/talon.db --build hg38 --o 06_annotation/Sample_1_talon
七、StringTie2 长读长组装
stringtie -L -G ref/genes.gtf -o 04_isoforms/Sample_1_stringtie2.gtf 03_alignment/Sample_1.sorted.bam
八、alternative promoter/polyA
长读长可以直接观察 transcript start site 和 polyA site。
import pandas as pd
isoforms = pd.read_csv("06_annotation/isoform_annotation.tsv", sep=" ")
apa = isoforms.groupby("gene_id")["polyA_site"].nunique().reset_index()
apa = apa.rename(columns={"polyA_site": "polyA_site_count"})
apa = apa[apa["polyA_site_count"] >= 2]
apa.to_csv("07_polyA/genes_with_multiple_polyA.tsv", sep=" ", index=False)
九、图例解释
| 类别 | 含义 |
|---|---|
| full-splice match | 与已知转录本剪接结构完全匹配 |
| novel in catalog | 使用已知 splice junction 的新组合 |
| novel not in catalog | 包含新的 splice junction |
| alternative promoter | 同一基因使用不同 TSS |
| alternative polyA | 同一基因使用不同 polyA site |
十、交付物
- long-read QC 报告
- sorted BAM 和 index
- isoform GTF/FASTA
- isoform annotation table
- novel isoform list
- isoform count/TPM matrix
- alternative promoter/polyA 表
- differential isoform usage 结果
- 重点基因 isoform browser plot